テーマ紹介:腸内病原細菌の毒素産生機構解明(クオラムセンシング)とその制御に関する研究

クオラムセンシングとは:

近年の研究から、単細胞生物である微生物も、個体間、つまり単細胞生物である微生物では細胞間でコミュニケーションを取り、集団として行動していることが分かってきた。中でも、“クオラムセンシング(Quorum Sensing)”と呼ばれる機構がよく研究されている。上図のように、微生物細胞が集団行動を起こす際に、自ら“オートインデューサー”(以前は細胞同士で誘引し合うので“フェロモン”とも呼ばれておりました)を分泌し、それによって周りの同種菌の菌密度を知らせ合い、その濃度がある閾値を超えた時点で、特定の遺伝子発現をオンにして(あるいはオフにして)、集団行動を始めます。特に、病原菌は、このシステムを病原毒素の発現制御などに利用しています。同種菌数が十分になるのを待って、機が熟したときに一気に攻撃に転ずる巧みな感染戦略と見て取れます(図1)。


クオラムセンシングを標的とする抗感染症剤とは:

我々は、このクオラムセンシングを逆手に取り、クオラムセンシングをブロックすることで、増殖は許しても、毒素生産を止める、という薬剤の開発を目指しこれまで研究を繰り広げてきました。日和見感染症菌などは、菌の増殖自体はさほど人体に害を及ぼさないこと。そしてまた、従来の抗生物質のように善玉菌も含めて無作為に菌を殺傷させてしまうと、後に薬剤耐性菌による反撃があるので、この抗病原性療法は、人体そのものに加えて人体の微生物叢にもやさしい化学療法として注目されております(図2)。


微生物工学研究室におけるグラム陽性細菌のクオラムセンシングを標的とした研究:

当グループでは環状ペプチドをオートインデューサー(Autoinducing Peptide: AIP(図3))とすることを特徴とするグラム陽性細菌を対象として、天然物のスクリーニングによるQS阻害剤の探索、および、化学合成を用いたQS阻害剤のデザイン、の2つのアプローチで新奇抗感染症薬の開発を展開してきました。特に、バンコマイシン耐性の獲得による院内感染で問題となっている日和見感染菌の腸球菌Enterococcus faecalisおよびメチシリン耐性菌の出現が問題となっている黄色ブドウ球菌のQSを標的として、図4に示すような阻害物質を見出してきております。特にZ-Bzl-YAA5911は白内障術後感染菌の一つである腸球菌のQS阻害剤として、網膜損傷を低減することも示されております(図5)。




近年の研究の展開/腸内フローラのクオラムセンシング:

さらに近年は、腸内フローラにおけるQSに注目し研究を進めています。ヒト腸内に多種存在するFirmicutes門細菌(特にClostridiales目細菌)には、免疫調節に非常に重要な役割を有する短鎖脂肪酸を生産する細菌や、肥満に関係するといわれる細菌、発癌や炎症に関与する二次胆汁酸を生産する細菌、食中毒や腸炎の起因菌まで、つまり善玉菌から悪玉菌そして病原菌まで幅広く知られています。我々は、これらのFirmicues門細菌のゲノムに多く見られるQS(agr制御系)の遺伝子群に着目しています。このagr制御系遺伝子の存在は、腸管において自己誘導ペプチドをコミュニケーションシグナルとするQSが行われていることを示唆しています(図6)。具体的にどのような表現型がこのQSによりコントロールされているか不明のものが多いですが、競合的な腸管生態系において少しでも優位に生存するために利用されていることが想定され、その実態を一つずつ明らかにしたいと考えています。一方、我々のグループではQSを人為的に制御する技術を蓄積しているので、腸内フローラでのQSもこれらの方法によって制御できるのではないかと考えました。そこで、我々は腸内細菌叢で質・量ともに重要な位置を占めるクロストリジア綱細菌群のコミュニケーションネットワークの一端を明らかにし、さらにはQS阻害剤を用いたクロストリジア綱細菌群コミュニティーへの人為的介入にチャレンジしています。


これまでに得られた研究成果として、Clostridium perfringens(ウェルシュ菌)のAIPアンタゴニスト創製に成功しております。C. perfringensはAIPCp(Cys-Leu-Trp-Phe-Thrチオラクトン)によりθトキシンであるパーフリンゴライシンの遺伝子pfoAの発現制御を行っています。我々は、そのAIPCpの構造を基にIC50=0.72 μMのアンタゴニスト(Z-Cys-Leu-Trp-Ala-Serチオラクトン)の創製に成功しています(Pal Singh, R. et al., FEMS Microbiol. Letters 2015, 362(22))。

また、以前から酪酸菌として知られるClostridium butyricumのプロバイオティクス株Miyairi588株がC. perfringensの毒素生産を抑制することは知られていました。そのAIPCbの構造は、AIPCpの構造に類似することから、AIPCp のアンタゴニストとして機能し、C. perfringensの毒素生産を抑制する可能性が考えられました。そこで、AIPCbを化学合成して、実際にC. perfringensのθ毒素遺伝子pfoAの転写誘導を抑制するかどうかを確認しました。その結果、AIPCbはサブマイクロモーラーレベルでAIPCpのpfoAの転写誘導を抑制し、θ毒素の生産を抑制することが明らかとなりました。本内容は共同研究グループであるミヤリサン製薬株式会社および金沢大学・清水徹博士のグループと共同で国際特許(WO2015119170AI)を取得しております(図7)。


さらに、C. perfringensのQSのもう一つの興味深い減少として、我々はクオラムクエンチング現象(QQ)に注目し、その機構についての詳細を明らかにしております。C. perfringensのQSはQSとしては珍しく、対数増殖期中期にそのQSが最大となり、対数増殖期後期に著しくQSが抑制されるQQ現象が見られます。我々は、このQQ現象がC. perfringens自身が発酵生産する酢酸や酪酸により引き起こされることを明らかにしました。またこのQQ現象は、有機酸のみならず無機酸でも起こることも明らかにされました。この現象を利用した感染症制御に注目されるところです(図7)(K. Adachi et al., J. Biosci. Bioeng., 2018, 125(5), 525-531. doi: 10.1016/j.jbiosc.2017.12.019)。


発表論文

【原著論文】

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  • Littlewood, S., Tattersall, H., Hughes, C. S., Hussain, R., Ma, P., Harding, S. E., Nakayama, J., Phillips-Jones, M. K., The gelatinase biosynthesis-activating pheromone binds and stabilises the FsrB membrane protein in Enterococcus faecalis quorum sensing (2020) FEMS Letters, 594(3): 553-563. doi:10.1002/1873-3468.13634.
  • Adachi, K., Ohtani, K., Kawano, M., Singh, R.P., Yousuf, B., Sonomoto, K., Shimizu, T., Nakayama, J.* Metabolic dependent and independent pH-drop shuts down VirSR quorum sensing in Clostridium perfringens (2018) J. Bioscience and Bioengineering, 125(5), 525-531. doi: 10.1016/j.jbiosc.2017.12.019.
  • Igarashi, Y., Yamamoto, K., Fukuda, T., Shojima, A., Nakayama, J., Carro, L., Trujillo, M.E. Arthroamide, a cyclic depsipeptide with quorum sensing inhibitory activity from Arthrobacter sp. (2015) Journal of Natural Products, 78(11), 2827-2831. doi:10.1021/acs.jnatprod.5b00540.
  • Igarashi, Y., Gohda, F., Kadoshima, T., Fukuda, T., Hanafusa, T., Shojima, A., Nakayama, J., Bills, G.F., Peterson, S. Avellanin C, an inhibitor of quorum-sensing signaling in Staphylococcus aureus, from Hamigera ingelheimensis (2015) Journal of Antibiotics 68(11), 707-710. doi: 10.1038/ja.2015.50.
  • Pal Singh, R., Okubo, K.-I, Ohtani, K., Adachi, K., Sonomoto, K., Nakayama, J.* Rationale design of quorum-quenching peptides that target the VirSR system of Clostridium perfringens (2015) FEMS Microbiology Letters 362(22), fnv188. doi:10.1093/femsle/fnv188.
  • Desouky, S.E., Shojima, A., Singh, R.P., Matsufuji, T., Igarashi, Y., Suzuki, T., Yamagaki, T., Okubo, K.-I., Ohtani, K., Sonomoto, K., Nakayama, J.* Cyclodepsipeptides produced by actinomycetes inhibit cyclic-peptide-mediated quorum sensing in Gram-positive bacteria (2015) FEMS Microbiology Letters 362(14), fnv109. doi:10.1093/femsle/fnv109.
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  • Teixeira, N., Varahan, S., Gorman, M.J., Palmer, K.L., Zaidman-Remy, A., Yokohata, R., Nakayama, J., Hancock, L.E., Jacinto, A., Gilmore, M.S., de Fatima Silva Lopes, M. Drosophila host model reveals new Enterococcus faecalis quorum-sensing associated virulence factors (2013) PLoS ONE 8(5), e64740. doi:10.1371/journal.pone.0064740.
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  • 【総説】

  • 安達桂香,中山二郎*. 腸内細菌叢におけるケミカルコミュニケーション (2018) 腎臓内科・泌尿器科,7(6): 599-606.
  • Jiro Nakayama, Ravindra Pal Singh, Quorum quenching strategy targeting Gram-positive pathogenic bacteria, Advances in Microbiology and Infectious Diseases and Public Health, 2016.05
  • 西口賢三、中山二郎、園元謙二. 2006 腸球菌のfsr制御系を標的としたクォーラムセンシング阻害剤開発. 生物工学会誌. 84: 440-443
  • 中山二郎,田中笑美,西口賢三,園元謙二. ブドウ球菌および腸球菌のクオラムセンシング?環状ペプチドにより制御される病原因子の発現?. 臨床と微生物, 31(3), 251-259, 2004.03
  • 中山二郎. 2002. 日和見感染腸球菌におけるクォーラムセンシング. 化学と生物. 40: 406-412
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  • 中山二郎. 2005. 肺炎球菌およびその他のグラム陽性病原細菌のQuorum-sensing. 分子呼吸器病. 9: 26-32

  • メンバー紹介・研究テーマ

    【2020年度】

    本田香代(修士2年)・グラム陽性細菌のクオラムセンシングペプチドに関する研究
    重岡愛莉(修士2年)・酪酸菌のクオラムセンシングに関する研究
    岸本恵美(修士1年)・Clostridiodes difficileのクオラムセンシングに関する研究
    伊藤 瞭(修士1年)・酪酸菌のClostridium属病原細菌のクオラムセンシング阻害に関する研究